Produkty
Detekční souprava Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pro 2019-nCoV
Očekávané využití
Tato sada se používá pro kvalitativní detekci nového koronaviru (2019-nCoV) pomocí výtěrů z krku, výtěrů z nosohltanu, bronchoalveolární lavážní tekutiny a sputa. Výsledek detekce tohoto produktu slouží pouze pro klinickou referenci a neměl by být používán jako jediný důkaz pro klinickou diagnózu a léčbu. Doporučuje se komplexní analýza stavu v kombinaci s klinickými projevy pacienta a dalšími laboratorními testy.
Princip inspekce
Souprava je založena na jednokrokové technologii RT-PCR. Jako cílové oblasti amplifikace byly vybrány geny ORF1ab a N nového koronaviru 2019 (2019-nCoV). Specifické primery a fluorescenční sondy (sondy genu N jsou značeny FAM a sondy ORF1ab jsou značeny HEX) jsou navrženy k detekci RNA koronaviru nového typu 2019 ve vzorcích. Souprava také obsahuje endogenní detekční systém interní kontroly (sonda genu interní kontroly značená CY5) pro monitorování procesu odběru vzorků, amplifikace RNA a PCR, čímž se snižuje počet falešně negativních výsledků.
Hlavní komponenty
| Součásti | Objem()48T/Sada） |
| Reakční roztok RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probemix (ORF1ab, N gen, RNaseP gen) | 864 µl |
| Negativní kontrola | 1500 µl |
| Pozitivní kontrola nCOV (l ORF1ab N Gen) | 1500 µl |
Vlastní činidla: Reagencie pro extrakci nebo purifikaci RNA. Negativní/pozitivní kontrola: Pozitivní kontrolou je RNA obsahující cílový fragment, zatímco negativní kontrolou je voda bez nukleových kyselin. Během použití by se měly podílet na extrakci a měly by být považovány za infekční. Měly by být zacházeny a likvidovány v souladu s příslušnými předpisy.
Interním referenčním genem je lidský gen RnaseP.
Podmínky skladování a datum spotřeby
-20±5 ℃, vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování více než 5krát, platné po dobu 6 měsíců.
Použitelný nástroj
S FAM / HEX / CY5 a dalšími vícekanálovými fluorescenčními PCR přístroji.
Požadavky na vzorky
1. Použitelné typy vzorků: výtěry z krku, výtěry z nosohltanu, tekutina z bronchoalveolární laváže, sputum.
2. Odběr vzorku (aseptická technika)
Výtěr z hltanu: Otřete mandle a zadní stěnu hltanu dvěma tampony současně a poté ponořte hlavici tamponu do zkumavky s roztokem pro odběr vzorku.
Sputum: Po hlubokém kašli pacienta se odebere vykašlané sputum do zkumavky se šroubovacím uzávěrem obsahující roztok pro odběr vzorků; tekutina z bronchoalveolární laváže: Odběr vzorků provádí zdravotnický personál. 3. Skladování a přeprava vzorků
Vzorky pro izolaci viru a testování RNA by měly být testovány co nejdříve. Vzorky, které lze detekovat do 24 hodin, lze skladovat při 4 °C; ty, které nelze detekovat do 24 hodin,
hodiny by měly být skladovány při teplotě -70 °C nebo nižší (pokud není skladovací teplota -70 °C, měly by být
dočasně uloženo v chladničce při teplotě -20 °C). Vzorky by se během přepravy měly vyhnout opakovanému zmrazování a rozmrazování. Vzorky by měly být odeslány do laboratoře co nejdříve po odběru. Pokud je třeba vzorky přepravovat na delší vzdálenosti, doporučuje se skladování v suchém ledu.
Zkušební metody
1 Zpracování vzorku a extrakce RNA (oblast zpracování vzorku)
Pro extrakci RNA se doporučuje odebrat 200 μl tekutého vzorku. Související kroky extrakce naleznete v pokynech ke komerčním sadám pro extrakci RNA. Jak negativní, tak i negativní
Kontroly v této soupravě byly zapojeny do extrakce.
2 Příprava PCR činidel (prostor pro přípravu činidel)
2.1 Vyjměte všechny komponenty ze soupravy, rozmrazte je a promíchejte při pokojové teplotě. Před použitím centrifugujte při 8 000 ot/min po dobu několika sekund; vypočítejte potřebné množství činidel a reakční systém se připraví dle následující tabulky:
| Součásti | N porce (systém 25 µl) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 µl × N |
| Reakční roztok RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = počet testovaných vzorků + 1 (negativní kontrola) + 1 (nCOVpozitivní kontrola) | |
2.2 Po důkladném promíchání složek krátce centrifugujte, aby veškerá tekutina ze stěny zkumavky spadla na dno zkumavky, a poté do PCR zkumavky přidejte alikvotní podíl 20 µl amplifikačního systému.
3 Odběr vzorků (prostor pro přípravu vzorků)
Po extrakci přidejte 5 μl negativní a pozitivní kontroly. RNA testovaného vzorku se přidá do PCR reakční zkumavky.
Zkumavku pevně uzavřete a před přenosem do oblasti amplifikační detekce několik sekund centrifugujte při 8 000 ot/min.
4 PCR amplifikace (amplifikovaná detekční oblast)
4.1 Umístěte reakční zkumavku do měřicí cely přístroje a nastavte parametry takto:
| fáze | Cyklus číslo | Teplota(°C) | Čas | sbírkamísto |
| Zvrátittranskripce | 1 | 42 | 10 minut | - |
| Předdenaturacen | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15 s | - |
| 60 | 30. léta | sběr dat |
Výběr detekčního kanálu přístroje: Pro fluorescenční signál vyberte kanály FAM, HEX a CY5. Pro referenční fluorescenční signál NONE prosím nevybírejte ROX.
5 Analýza výsledků (Nastavení naleznete v experimentálních pokynech každého přístroje)
Po reakci uložte výsledky. Po analýze upravte počáteční hodnotu, koncovou hodnotu a prahovou hodnotu základní linie podle obrázku (uživatel může upravit podle skutečné situace, počáteční hodnotu lze nastavit na 3~15, koncovou hodnotu na 5~20) v logaritmickém grafu. Na prahové hodnotě okna je prahová čára v logaritmické fázi a amplifikační křivka negativní kontroly je přímka nebo pod prahovou čárou.
6 Kvalitativní kontrola (součástí testu je procedurální kontrola) Negativní kontrola: Žádná zřetelná amplifikační křivka pro detekční kanály FAM, HEX, CY5
Pozitivní kontrola COV: zřetelná amplifikační křivka detekčních kanálů FAM a HEX, hodnota Ct ≤ 32, ale žádná amplifikační křivka kanálu CY5;
Výše uvedené požadavky musí být splněny současně ve stejném experimentu, jinak je experiment neplatný a je nutné jej opakovat.
7 Stanovení výsledků.
7.1 Pokud se v kanálech FAM a HEX testovaného vzorku nenachází amplifikační křivka nebo hodnota Ct > 40 a v kanálu CY5 se nachází amplifikační křivka, lze usoudit, že ve vzorku není přítomna RNA nového koronaviru 2019 (2019-nCoV);
.2 Pokud má testovaný vzorek zřetelné amplifikační křivky v kanálech FAM a HEX a hodnota Ct je ≤40, lze usoudit, že vzorek je pozitivní na nový koronavirus z roku 2019 (2019-nCoV).
7.3 Pokud má testovaný vzorek jasnou amplifikační křivku pouze v jednom kanálu FAM nebo HEX a hodnota Ct je ≤40 a v druhém kanálu není amplifikační křivka, je třeba výsledky znovu otestovat. Pokud jsou výsledky opakovaného testu konzistentní, lze vzorek posoudit jako pozitivní pro nový test.
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Pokud je výsledek opakovaného testu negativní, lze usoudit, že vzorek je negativní na nový koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivní hodnota úsudku
Referenční hodnota CT soupravy je stanovena metodou ROC křivky a referenční hodnota interní kontroly je 40.
Interpretace výsledků testů
1. Každý experiment by měl být testován na negativní a pozitivní kontroly. Výsledky testů lze stanovit pouze tehdy, pokud kontroly splňují požadavky na kontrolu kvality.
2. Pokud jsou detekční kanály FAM a HEX pozitivní, může být výsledek z kanálu CY5 (kanál interní kontroly) negativní kvůli systémové konkurenci.
3. Pokud je výsledek interní kontroly negativní a detekční kanály FAM a HEX zkumavky jsou také negativní, znamená to, že systém je deaktivován nebo je operace nesprávná a test je neplatný. Proto je třeba vzorky znovu otestovat.
