produkty
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR detekční sada pro 2019-nCoV
Očekávané použití
Tato souprava se používá pro kvalitativní detekci nového koronaviru (2019-nCoV) pomocí výtěrů z krku, výtěrů z nosohltanu, tekutiny z bronchoalveolární laváže, sputa. Výsledek detekce tohoto produktu je pouze pro klinickou referenci a neměl by být používán jako jediný důkazy pro klinickou diagnózu a léčbu. Doporučuje se komplexní analýza stavu v kombinaci s klinickými projevy pacienta a dalšími laboratorními testy.
Princip kontroly
Souprava je založena na jednokrokové technologii RT-PCR.Ve skutečnosti byly jako cílové oblasti amplifikace vybrány geny ORF1ab a N nového koronaviru (2019-nCoV) z roku 2019.Specifické primery a fluorescenční sondy (sondy N genu jsou značeny FAM a sondy ORF1ab jsou značeny HEX) jsou navrženy tak, aby detekovaly RNA 2019 nového typu koronaviru ve vzorcích.Souprava také obsahuje detekční systém endogenní vnitřní kontroly (genová sonda vnitřní kontroly značená CY5) pro monitorování procesu odběru vzorku, amplifikace RNA a PCR, čímž se snižuje výskyt falešně negativních výsledků.
Hlavní komponenty
| Komponenty | Hlasitost(48T/sada) |
| RT-PCR reakční roztok | 96 ul |
| nCOV primer TaqMan probemix (ORF1ab, N gen, RNaseP gen) | 864 ul |
| Negativní kontrola | 1500 ul |
| Pozitivní kontrola nCOV (l ORF1ab N Gen) | 1500 ul |
Vlastní reagencie: RNA extrakční nebo purifikační reagencie.Negativní/pozitivní kontrola: Pozitivní kontrola je RNA obsahující cílový fragment, zatímco negativní kontrola je voda bez nukleových kyselin.Během používání by se měly podílet na extrakci a měly by být považovány za infekční.Je třeba s nimi zacházet a likvidovat je v souladu s příslušnými předpisy.
Vnitřní referenční gen je lidský gen RnaseP.
Podmínky skladování a datum expirace
-20±5 ℃, zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování více než 5krát, platí po dobu 6 měsíců.
Použitelný nástroj
S FAM / HEX / CY5 a dalším vícekanálovým fluorescenčním PCR přístrojem.
Požadavky na vzorky
1. Použitelné typy vzorků: výtěry z krku, výtěry z nosohltanu, tekutina z bronchoalveolární laváže, sputum.
2. Odběr vzorků (aseptická technika)
Výtěr z hltanu: Otřete mandle a zadní stěnu hltanu dvěma tampony současně a poté ponořte hlavu tamponu do zkumavky obsahující roztok pro odběr vzorků.
Sputum: Poté, co pacient hluboce zakašle, odeberte vykašlé sputum do zkumavky se šroubovacím uzávěrem obsahující roztok pro odběr vzorků;tekutina z bronchoalveolární laváže：Odběr vzorků lékařskými odborníky.3.Skladování a přeprava vzorků
Vzorky pro izolaci viru a testování RNA by měly být testovány co nejdříve.Vzorky, které lze detekovat do 24 hodin, lze skladovat při 4 °C;ty, které nelze zjistit do 24
hodiny by měly být skladovány při teplotě -70 ℃ nebo nižší (pokud nejsou podmínky skladování -70 ℃, měly by být
dočasně skladováno v chladničce -20 °C).Vzorky by se měly během přepravy vyvarovat opakovaného zmrazování a rozmrazování.Vzorky by měly být odeslány do laboratoře co nejdříve po odběru.Pokud je třeba vzorky přepravovat na velké vzdálenosti, doporučuje se skladování suchým ledem.
Testovací metody
1 Zpracování vzorků a extrakce RNA (oblast zpracování vzorků)
Pro extrakci RNA se doporučuje odebrat 200 μl kapalného vzorku.Související kroky extrakce naleznete v pokynech komerčních souprav pro extrakci RNA.Jak negativní, tak negativní
kontroly v této soupravě se podílely na extrakci.
2 Příprava reagencií PCR (oblast pro přípravu reagencií)
2.1 Vyjměte všechny komponenty ze soupravy a rozmrazte a promíchejte při pokojové teplotě.Před použitím centrifugujte při 8 000 ot./min.vypočítejte požadované množství činidel a reakční systém se připraví tak, jak je uvedeno v následující tabulce:
| Komponenty | N porce (25µl systém) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 ul × N |
| RT-PCR reakční roztok | 2 µl × N |
| *N = počet testovaných vzorků + 1 (negativní kontrola) + 1 (nCOVpozitivní kontrola) | |
2.2 Po důkladném promíchání složek krátce centrifugujte, aby veškerá kapalina na stěně zkumavky spadla na dno zkumavky, a poté alikvotujte 20 µl amplifikačního systému do zkumavky PCR.
3 Odběr vzorků (prostor pro přípravu vzorků)
Po extrakci přidejte 5 μl negativní a pozitivní kontroly.RNA vzorku, který má být testován, se přidá do reakční zkumavky PCR.
Zkumavku pevně uzavřete a před přenesením do detekční oblasti amplifikace několik sekund odstřeďujte při 8 000 ot./min.
4 PCR amplifikace (amplifikovaná detekční oblast)
4.1 Umístěte reakční zkumavku do vzorkové cely přístroje a nastavte parametry následovně:
| etapa | Cyklus číslo | Teplota(°C) | Čas | sbírkamísto |
| Zvrátittranskripce | 1 | 42 | 10 min | - |
| Předdenaturacen | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30. léta | sběr dat |
Výběr kanálu detekce přístroje: Vyberte kanál FAM、HEX、CY5 pro fluorescenční signál.Pro referenční fluorescenční NONE, nevybírejte prosím ROX.
5 Analýza výsledků (nastavení naleznete v experimentálních pokynech každého přístroje)
Po reakci uložte výsledky.Po analýze upravte počáteční hodnotu, konečnou hodnotu a prahovou hodnotu základní linie podle obrázku (uživatel může upravit podle skutečné situace, počáteční hodnotu lze nastavit na 3~15, konečnou hodnotu lze nastavit na 5~20, úprava) v logaritmickém grafu Na prahu okna je prahová čára v logaritmické fázi a amplifikační křivka negativní kontroly je přímka nebo pod prahovou čárou).
6 Kvalitní kontrola（V testu je zahrnuta procedurální kontrola） Negativní kontrola: Žádná zjevná amplifikační křivka pro detekční kanály FAM, HEX, CY5n
COV pozitivní kontrola: zřejmá amplifikační křivka detekčních kanálů FAM a HEX, hodnota Ct ≤ 32, ale žádná amplifikační křivka kanálu CY5;
Výše uvedené požadavky musí být splněny současně ve stejném experimentu;jinak je experiment neplatný a je třeba jej opakovat.
7 Stanovení výsledků.
7.1 Pokud v kanálech FAM a HEX testovacího vzorku není žádná amplifikační křivka nebo hodnota Ct > 40 a v kanálu CY5 je amplifikační křivka, lze usoudit, že v roce 2019 neexistuje žádný nový koronavirus (2019-nCoV) RNA ve vzorku;
.2 Pokud má testovaný vzorek zjevné amplifikační křivky v kanálech FAM a HEX a hodnota Ct je ≤40, lze usoudit, že vzorek je pozitivní na nový koronavirus z roku 2019 (2019-nCoV).
7.3 Pokud má testovaný vzorek jasnou amplifikační křivku pouze v jednom kanálu FAM nebo HEX a hodnota Ct je ≤40 a ve druhém kanálu není žádná amplifikační křivka, je třeba výsledky znovu otestovat.Pokud jsou výsledky opakovaného testu konzistentní, může být vzorek posouzen jako pozitivní na nový
koronavirus 2019 (2019-nCoV).Pokud je výsledek opakovaného testu negativní, lze usoudit, že vzorek je negativní na nový koronavirus z roku 2019 (2019-nCoV).
Hodnota pozitivního úsudku
K určení referenční hodnoty CT soupravy se používá metoda ROC křivky a referenční hodnota vnitřní kontroly je 40.
Interpretace výsledků testů
1. Každý experiment by měl být testován na negativní a pozitivní kontroly.Výsledky testů lze určit pouze tehdy, když kontroly splňují požadavky na kontrolu kvality
2. Když jsou kanály detekce FAM a HEX pozitivní, výsledek z kanálu CY5 (kanál vnitřní kontroly) může být negativní kvůli konkurenci systému.
3. Je-li výsledek interní kontroly negativní, pokud jsou detekční kanály FAM a HEX zkumavky také negativní, znamená to, že systém je deaktivován nebo operace je chybná, ● test je neplatný.Proto je nutné vzorky znovu otestovat.
